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Analisi dei cannabinoidi - parte 2 - Strumenti analitici

L'analisi dei cannabinoidi è una questione molto delicata, specialmente per i molteplici interessi economici e terapeutici che riveste per una moltitudine di aziende, coltivatori, laboratori e, non ultimi, utilizzatori. Strumenti e preparazione possono fare la differenza in fase di test, sia sui risultati che su calendari e portafogli dei richiedenti, ma cerchiamo di capire come mai.

Introduzione | la strumentazione

Per l'analisi dei cannabinoidi si utilizzano tecniche cromatografiche. I metodi cromatografici sfruttano le interazioni degli analiti (i composti che andiamo a ricercare) con due fasi immiscibili fra loro: una stazionaria (la colonna) e una mobile che percola attraverso la prima. La fase mobile definisce il tipo di cromatografia, liquida o gassosa. La fase stazionaria porta alla separazione degli analiti e ne permette la caratterizzazione. Questa caratterizzazione avviene in base a: tempi di ritenzione (per quanto tempo l'analita percorre la fase stazionaria); intensità del segnale dato dall'analita, in confronto a quello prodotto da uno standard di riferimento. Alla fine della colonna troviamo un rivelatore e un calcolatore che permettono di quantificare e/o identificare le sostanze in uscita, traducendo i dati in un cromatogramma.

Tutto si fa subito troppo complicato? Comincia dalla Parte 1!

Analisi dei cannabinoidi - parte 1 - Introduzione

Cromatografia Liquida (LC, HPLC)

La cromatografia liquida, si basa sulla ripartizione dei composti tra una fase stazionaria solida e una fase mobile liquida. Comprende una colonna cromatografica costituita da un tubo corto di acciaio inossidabile (tipicamente 30-300 mm di lunghezza e 6 mm di diametro esterno) costituito da particelle molto piccole (tipicamente 5 μm di diametro) di una fase stazionaria, come la silice ad esempio. In queste condizioni, una fase mobile (tipicamente una miscela di solventi come acqua e acetonitrile e/o metanolo) viene forzata attraverso la colonna a velocità regolata, utilizzando una pompa ad alta pressione. Una piccola aliquota dell'estratto con solvente viene iniettata nella fase mobile che trasporta il campione nella colonna. I composti presenti nell'estratto emergeranno dall'estremità della colonna in tempi diversi (noti come tempo di ritenzione) a seconda della forza della loro attrazione verso la fase stazionaria.

A quel punto il campione nella FM comincerà a percorrerne la colonna come un gruppo di scolari in gita percorre una strada piena di attrazioni. Qualcuno sarà molto interessato da ogni vetrina (grande affinità con la FS) e uscirà dalla strada dopo più tempo; qualcuno invece si soffermerà solo davanti ad alcune attrazioni, mentre altri percorreranno la strada senza mai fermarsi. Analisi dei cannabinoidi - parte 1 - Introduzione

Vantaggi/Svantaggi LC

I vantaggi di LC sono che può essere utilizzato per composti non volatili e termicamente labili, come il THCA, che non sono adatti per l'analisi GC. Il sistema HPLC-UV si rivela particolarmente indicato per l'analisi della potency in R&D e autocontrollo considerati i tempi e le spese ridottissime. I principali svantaggi sono legati al sistema MS e descritti poco più avanti.

HPLC-UV

Cromatografia liquida ad alta prestazione, o High Performance Liquid Chromatography (HPLC). In questo caso il sistema è dotato di rivelatore UV, in grado di leggere l’assorbimento della radiazione ultravioletta di alcuni gruppi funzionali propri di alcune delle molecole di nostro interesse (CBD, THC, etc nel nostro caso) presenti nella canapa.

Vantaggi HPLC-UV

Questa metodologia permette di avere analisi affidabili in tempi brevi e con costi molto ridotti. Considerate le esigenze analitico-normative legate alla cannabis, l'analisi dei principi attivi in campo (da 242/2016) può tranquillamente avvenire, almeno in senso preventivo, in HPLC. Anche in contesti di R&S o gestione del magazzino, il test in HPLC-UV consente di lavorare su molti campioni, velocemente e con un'indubbia economicità e affidabilità dei risultati.

LC-MS; LC-MS/MS

È possibile utilizzare diversi metodi per rilevare i composti separati man mano che emergono dall'estremità della colonna LC. Oltre al rilevatore UV, possiamo utilizzare una cromatografia liquida con spettrometria di massa e spettrometria di massa tandem (LC-MS e LC-MS/MS). Lo sviluppo di LC-MS è stato limitato per molti anni a causa dell'incompatibilità del processo di ionizzazione del fascio di elettroni MS (che deve avvenire nel vuoto), con un flusso di liquido continuo che emerge dalla colonna LC. Questo problema è stato superato negli anni '80 dallo sviluppo della sorgente di ioni elettrospray (ESI), che sfrutta la nebulizzazione del liquido in goccioline cariche. Il solvente in queste goccioline evapora rapidamente e la carica elettrica residua viene trasferita all'analita per creare ioni molecolari; in definitiva però il sistema ESI trasferisce relativamente poca energia alle molecole dell'analita. Per via di questa dinamica, l'LC-MS è quindi meno specifico di GC-MS poiché lo spettro di massa contiene meno informazioni strutturali rispetto a GC-MS.

Svantaggi LC-MS

Oltre ai limiti di specificità rispetto al GC-MS, un ulteriore problema con ESI è la soppressione ionica, che può verificarsi quando più componenti eluiscono contemporaneamente e sono presenti nelle stesse goccioline di spruzzatura. Ciò può comportare il trasferimento preferenziale della carica elettrica a uno dei componenti, sopprimendo gli ioni dell'altro o degli altri componenti. Questo può essere un limite alla sensibilità di LC-MS e può portare a risultati quantitativi inaffidabili. Gli standard di riferimento interni etichettati con isotopi stabili possono essere utilizzati per superare il problema della quantificazione, altrimenti è necessario sviluppare metodi di preparazione del campione per ridurre al minimo gli effetti della soppressione ionica.

Cromatografia Gassosa

In gascromatografia, la fase mobile è un gas (gas carrier) che fluisce attraverso una colonna in cui è posta la fase stazionaria. I meccanismi di separazione dei componenti della miscela sono determinati dalla fase stazionaria in quanto il carrier ha la sola funzione di trasporto. Per essere analizzata in GC, una miscela deve poter passare in fase vapore alla temperatura di lavoro. È un metodo analitico ad alta risoluzione (molto preciso) con cui si può disporre di molteplici e differenti fasi stazionarie. Ha una buona sensibilità con diversi detector.

Vantaggi/Svantaggi GC

La rilevazione tramite cromatografia gassosa è tendenzialmente più puntuale, raggiungendo una maggiore sensibilità. Purtroppo il GC ha un limite legato al riscaldamento del campione e alle molecole termolabili, come per l'appunto sono tutti i cannabinoidi acidi (THCA, CBDA). Questi acidi cannabinolici vengono convertiti in fase di analisi rendendo impossibile distinguere tra questi e le forme attive decarbossilate già in precedenza.

Appronfondisci la questione cannabinoidi: Cannabinoidi | Quali sono?

GC-FID

Nel caso del FID (Rivelatore a ionizzazione di fiamma), lo strumento sfrutta la presenza di ioni, introdotti attraverso idrogeno, nella fiamma. La fiamma risultante dalla combustione di idrogeno in aria decompone i composti organici producendo atomi caricati positivamente (cationi) ed elettroni. Al fine di determinare tali ioni, due elettrodi sono disposti lungo il percorso della fiamma. Nel momento dell'incontro del catione con l'elettrodo negativo, questi gli cede gli elettroni mancanti generando una debole corrente tra i due elettrodi. La corrente viene rilevata tramite un sensibile amperometro e quindi visualizzata su di un display.

Vantaggi GC-FID

Il GC-FID permette di effettuare test con costi ridotti, velocemente e attraverso metodologie semplici e facilmente riproducibili. Inoltre garantisce livelli di sensibilità e puntualità superiori all'HPLC-UV

GC-MS | GC-MS/MS

In questo caso, il rilevatore a valle del gascromatografo è uno spettrometro di massa, ovvero un sistema in grado di rompere le molecole in frammenti ionici sotto una pioggia di elettroni e poi misurare la loro abbondanza sulla base del loro rapporto massa/carica. I frammenti ionici vengono filtrati con uno (GC/MS) o più (GC/MS/MS) filtri di massa, generalmente di natura magnetica quadrupolare, prima di conteggiarli con un rivelatore aspecifico (tubo fotomoltiplicatore). Alla fine, oltre ad un cromatogramma tradizionale, si ottiene anche un grafico dove per ogni frammento è riportata l’intensità. Questo tracciato, chiamato spettro di massa, è una specie di impronta digitale della molecola alla quale si riferisce e consente pertanto un riconoscimento più affidabile dei picchi cromatografici. Se si necessita di maggiore sicurezza nel riconoscimento, soprattutto in caso di campioni con matrici molto complesse conviene utilizzare un GC/MS/MS che funziona sullo stesso principio del precedente ma sfrutta frammentazioni in serie. In entrambi i casi la quantizzazione è effettuata sulla base dell’area di un frammento caratteristico, rispetto ad un segnale ottenuto per uno standard a concentrazione nota.

Svantaggi GC-MS, GC-MS/MS

Oltre al limite nella valutazione dei cannabinoidi acidi, si parla di una metodologia di analisi estremamente complessa e costosa, sia in termini di macchinari ed exprertise, che di tempo richiesto per il processo di analisi stesso. Se considerato in relazione alle necessità effettive, quando si parla di analisi dei cannabinoidi, probabilmente è un metodo fin troppo complesso e puntuale, che rischia di portare a una riduzione dei campioni analizzati a fronte di una (inutilmente) grandissima precisione del risultato.

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